人γ干擾素(IFN-γ)ELISA檢測試劑盒實驗使用說明書
BS-0033人γ干擾素(IFN-γ)ELISA試劑盒
一、實驗原理
本試劑盒采用雙抗體夾心酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測人γ干擾素(IFN-γ)水平。實驗步驟如下：
包被抗體?：將抗人IFN-γ單克隆抗體預包被于微孔板，形成固相抗體。
抗原結合?：加入樣本或標準品，IFN-γ與固相抗體結合。
酶標抗體反應?：加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的檢測抗體，形成“抗體-抗原-酶標抗體”復合物。
顯色與檢測?：加入底物TMB顯色，HRP催化TMB轉化為藍色，酸終止后變黃色。顏色深淺與IFN-γ濃度正相關，用酶標儀在450nm波長測定吸光度(OD值)，通過標準曲線計算樣本濃度。
二、試劑盒組成
預包被微孔板?：12孔×8條(96孔配置)或12孔×4條(48孔配置)，2-8℃保存。
標準品?：凍干粉，復溶后配制梯度濃度(如1000→500→250→…→15.625 pg/mL)，2-8℃保存。
酶標試劑?：HRP標記的檢測抗體，2-8℃避光保存。
顯色底物?：TMB溶液，避光保存。
終止液?：2M溶液，操作時需戴手套。
其他?：封板膜、洗滌液(20×濃縮液)、樣本稀釋液、說明書。
三、樣本收集與處理
樣本類型?：
血清?：室溫血液自然凝固10-20分鐘，離心(2000-3000轉/分，20分鐘)，收集上清。
血漿?：EDTA或肝素抗凝，離心后取上清。
細胞培養上清?：離心去除顆粒物，避免反復凍融。
其他體液?(如腦脊液、胸腹水)：澄清后檢測。
保存?：短期(≤7天)2-8℃保存，長期需分裝凍存于-80℃，避免反復凍融。
四、實驗步驟
試劑準備?：
洗滌液：將20×濃縮液用蒸餾水稀釋為1×工作液。
標準品：凍干粉加1mL標準品稀釋液復溶，梯度稀釋(如1000→500→…→15.625 pg/mL)。
加樣?：
標準品孔：各加50μL不同濃度標準品。
樣本孔：加10μL樣本+40μL樣本稀釋液(血清/血漿建議1:5稀釋，細胞上清1:2稀釋)。
溫育?：37℃避光孵育30分鐘。
洗滌?：甩干孔內液體，用洗滌液注滿各孔，靜置1分鐘后甩干，重復5次，拍干。
酶標抗體?：每孔加50μL酶標試劑，37℃孵育30分鐘。
顯色?：每孔加50μL顯色底物，37℃避光孵育15分鐘。
終止?：每孔加50μL終止液，混勻后立即測定OD值(450nm)。
五、結果計算
標準曲線?：以標準品濃度為橫坐標(X)，OD值為縱坐標(Y)，擬合直線回歸方程。
樣本濃度?：將樣本OD值代入方程，乘以稀釋倍數，得到實際濃度(pg/mL)。
六、注意事項
試劑保存?：未使用板條密封保存于2-8℃，避免受潮;TMB避光。
樣本處理?：避免溶血、高血脂樣本;高濃度樣本需預實驗確定稀釋倍數。
操作規范?：
加樣避免氣泡，槍頭一次性使用。
溫育時間嚴格控制在規定范圍內，防止蒸發。
洗滌，拍干時避免吸水紙直接接觸孔內。
質量控制?：每批次設空白孔(S0)及陰性對照。
安全提示?：終止液含酸，需戴手套操作;廢棄物按生物危害處理。
七、性能參數
靈敏度?：≤1.0 pg/mL。
檢測范圍?：15.63–1000 pg/mL。
精密度?：板內/板間變異系數
